Преподобный Серапион родился в конце XIV века в Юрьеве — нынешнем Тарту, — который тогда находился под властью немцев, старавшихся искоренить православие. Родители его были прихожанами русской церкви во имя святителя Николая. Он хорошо знал Священное Писание и творения святых отцов и не раз выступал в защиту православной веры.

Серапион владел латышским и чухонским языками и всю жизнь заботился о том, чтобы говорящие на них люди держались православия: одних укреплял наставлениями, других, уклонившихся в латинство или протестантство, старался вернуть в Церковь. Когда его самого стали силой склонять к чужой вере, он ушёл в Толвскую пустынь — туда, где начинал свои молитвенные труды преподобный Евфросин Псковский.

Около тридцати пяти лет от роду он поселился на реке Толве и стал учеником Евфросина, жившего тогда ещё в полном уединении, и разделил с ним пустынные подвиги и труды по устройству обители. Пришёл он уже иноком — где и когда принял постриг, неизвестно. Было и искушение: понадеявшись на собственные силы, он захотел уйти от наставника без благословения и начать самостоятельную жизнь, но тяжело поранил ногу, раскаялся в своеволии и вернулся к старцу. Приняв великую схиму, Серапион пятьдесят пять лет неотлучно пробыл рядом с Евфросином, строго соблюдая обет безмолвия.

Он ревностно исполнял монастырские уставы и особенно прилежал к церковной молитве. Ему принадлежат слова о том, что двенадцать псалмов, пропетых наедине в келье, не могут равняться одному «Господи, помилуй», пропетому в храме. Нестяжание он держал так строго, что описатель жития назвал его «мертвецем непогребенным». На всякую обиду он отвечал исключительным смирением: обвинял только себя и сам просил прощения у обидчика.

В последние годы преподобный прославился даром прозорливости и исцелений. В 1476 году крестьянин-латыш исцелился от гнойной раны на ноге, приложив к ней снег со следов святого. Серапион предсказал, что в год его смерти немцы пойдут на Псков, но обитель не пострадает, — так и вышло. Скончался он девяноста лет от роду, 8 сентября 1480 года, в день Рождества Пресвятой Богородицы; поскольку день преставления совпал с двунадесятым праздником, память его совершается 20 сентября. Тело ученика предал земле сам преподобный Евфросин. Мощи их положены рядом, а общая служба, составленная на 28 мая, называет Серапиона «спостником и другом» его наставника.

Преподобных принято писать в монашеском одеянии, со свитком или чётками в руке; Серапиона Псковского обычно изображают рядом с Евфросином — так их и почитают вдвоём. Икону берут как именную носящие имя Серапион; обращаются к преподобному с молитвой о выздоровлении болящих, о терпении обид и о даре молчания.