Будущий священномученик появился на свет 22 октября 1869 года в слободе Алексеевка, что в Бирюченском уезде Воронежской губернии, в крестьянской семье; в крещении его назвали Димитрием. Мать, дочь псаломщика, выданная замуж по бедности, долго молилась о сыне-священнике. Учился он в сельской школе, потом в Бирюченском духовном училище, а как один из лучших учеников был принят на казённый счёт в Воронежскую духовную семинарию.

Окончив её в 1890 году, он женился и был рукоположен во диакона. Вскоре овдовел, оставшись с младенцем-сыном; мальчика взяла на воспитание тёща, чтобы отец мог свободнее служить Церкви. В 1893 году он поступил в Киевскую духовную академию, в 1896-м принял постриг с именем Митрофан, через год был рукоположен во иеромонаха и окончил академию кандидатом богословия — за работу об аскетике святителя Василия Великого.

Дальше были годы преподавания: инспектор Иркутской духовной семинарии, с 1902 года ректор Могилёвской семинарии в сане архимандрита. В феврале 1907 года его хиротонисали во епископа Гомельского, викария Могилёвской епархии. Он сразу взялся за миссию: созвал совещание духовенства уезда, устроил в Гомеле миссионерские курсы, вошёл в синодальное совещание по устройству миссионерского дела. Много времени отнимали и обязанности в Государственной думе, так что к пастве он мог приезжать лишь наездами. С 1912 года он был епископом Минским и Туровским.

1 июля 1916 года Синод назначил его епископом Астраханским и Енотаевским. Прощаясь с Минском, владыка сказал, что перемещения не искал и привык вверять свою жизнь Промыслу Божию. В Астрахани он взялся за приходы и миссию, объехал Калмыцкую степь с самыми отдалёнными храмами, бывал в учебных заведениях и говорил ученикам, что одно образование не делает человека человеком без воспитания религиозного и нравственного. Он участвовал во Всероссийском Церковном Соборе и вернулся в город в декабре 1917 года; современники писали, что ни одна его служба не обходилась без проповеди, и народ шёл в те храмы, где он служил.

С 1918 года Астрахань жила гражданской войной. Давним трудом владыки было прославление священномученика Иосифа, митрополита Астраханского: ходатайство в Синод он отправил ещё в 1916 году, а торжество состоялось 11 мая 1919 года в Знаменском храме. К тому времени в городе шли расстрелы, и близкие уговаривали архиерея уехать, всё для этого приготовив. Он отказался — сказал, что не оставит паству, пока на глазах гибнут невинные, и что ни в чём не виновен перед Родиной и народом.

7 июня 1919 года, накануне праздника Святой Троицы, владыка служил всенощную в Троицкой церкви и остался ночевать у настоятеля. В первом часу ночи его арестовали: он спокойно надел рясу, благословил растерянных людей у двери и вышел. Прихожане кафедрального собора просили отпустить архиерея на поруки, но 6 июля 1919 года он был убит в тюрьме. Тела казнённых архиереев удалось вывезти тайно: священник за деньги договорился с возчиком, и убитых погребли у Покрово-Болдинского монастыря. В 2001 году священномученик Митрофан был причислен к лику святых.