Преподобный Стефан был старшим из сыновей преподобных Кирилла и Марии Радонежских. Семи лет его вместе с младшими братьями, Варфоломеем и Петром, отдали учиться грамоте, и учение давалось ему легко. Женился он в Радонеже, на девице благочестивой; родились у них двое сыновей — Климент и Иоанн. Молодая жена вскоре умерла, и Стефан решил принять постриг: он ушёл в Покровский Хотьков монастырь и с великим усердием подвизался в посте и молитве.

После похорон родителей брат Варфоломей упросил его вместе искать пустынное место для уединённой молитвы. Такое место нашлось в лесной чаще, на горе Маковец. Братья поставили хижину, келию и рядом небольшую церковь. Когда пришло время её освящать, Варфоломей спросил у старшего совета: во имя какого святого? Стефан напомнил ему то, о чём не раз говорили родители, — что Господь избрал его ещё до рождения, а священники и старцы истолковали это как знак, что ребёнок будет учеником Святой Троицы; значит, и церковь должна быть освящена во имя Святой Троицы. Варфоломей ответил, что того же хотел и сам, а спрашивал ради смирения. По благословению митрополита Феогноста храм освятили.

Некоторое время Стефан жил на Маковце с братом, но суровая пустынная жизнь стала его тяготить, и он ушёл в Москву. Епифаний Премудрый объяснял это разницей наклонностей: братьев родила одна мать, но один выбрал себе городскую обитель, а другой обратил пустыню в подобие города. В столице старший брат поселился в Богоявленском монастыре — той обители, которой покровительствовали семьи великого князя и городского тысяцкого. Там же принял постриг будущий митрополит Алексий; вместе с ним и старцем Геронтием Стефан пел на клиросе. Великий князь Симеон Иванович Гордый избрал его своим духовным отцом, а вслед за князем к нему пошли и многие бояре.

Всё переменилось, когда во время чумы 1353 года умерли и князь Симеон, и митрополит Феогност. Стефан вернулся на Маковец, взяв с собой двенадцатилетнего сына Иоанна, и попросил младшего брата постричь мальчика. Преподобный Сергий постриг его с именем Феодор — тот впоследствии основал в Москве Симонов монастырь.

С возвращением старшего брата в обители начались нестроения. Стефан считал, что почитать должны больше его, и держался древнего порядка особного жительства, тогда как Сергий, получив в 1377 году грамоту от послов Константинопольского Патриарха, вводил общежитие. Однажды на вечерне Стефан с гневом спросил вслух, кто здесь игумен и не он ли первым основал эту обитель. Сергий не ответил ни слова, а после службы тихо ушёл из монастыря, никем не замеченный. Позже братия упросила его вернуться. Стефан удалился в один из московских монастырей, а потом снова жил в Троицкой обители; архиепископ Никон (Рождественский) считал, что он раскаялся в своей вспышке и примирился с братом.

Точное время его кончины неизвестно. Судя по тому, что Епифаний Премудрый начал собирать сведения о преподобном Сергии ещё в 1393–1394 годах, Стефан пережил брата и скончался, вероятно, в середине или во второй половине 90-х годов XIV века.