Преподобный Стефан жил в одно время с преподобным Сергием Радонежским и был ему близким собеседником. Родился и вырос он в Киеве, там же, в Печерской обители, принял иночество и несколько лет прожил в строгом воздержании и послушании у старцев.

Когда положение православных на юге Руси стало тяжёлым и монахи начали расходиться из киевских монастырей, Стефан ушёл на север, в Москву. Великий князь Иоанн II предложил ему на выбор любой столичный монастырь, но преподобный хотел пустыни. Он поселился в лесном урочище Махрище, в тридцати пяти верстах от обители преподобного Сергия: водрузил крест, срубил келью, выкорчевал лес под пашню. Скрыться не удалось — к нему стали приходить люди, и не позднее 1358 года, по благословению святителя Алексия, митрополита Московского, здесь возник монастырь во имя Живоначальной Троицы. Святитель Алексий рукоположил Стефана во иеромонаха и поставил игуменом.

Обитель быстро росла, жила по общежительному уставу, а сам игумен ничем не отличался от братии ни одеждой, ни пищей и первенствовал только в молитве и трудах. К нему шли за советом и монахи, и миряне; приходил и преподобный Сергий. Однажды тот появился в Махрище, не сказав, что ушёл из своей Лавры из-за огорчения от братии. Стефан встретил его со всеми иноками, старцы поклонились друг другу до земли и несколько дней провели вместе. На прощание Сергий попросил дать ему спутника, знающего пустынные места, и Стефан отпустил с ним своего ученика Симона, проводив их до источника за три версты от обители; позже на месте расставания поставили часовню. Симон и указал преподобному Сергию место на реке Киржач.

Вскоре такое же испытание пришло и к самому Стефану. Четверо соседей-землевладельцев, братья Юрковские, испугались, что их имения отойдут монастырю, и стали угрожать игумену убийством. Вразумления не помогали, и преподобный, оставив вместо себя священноинока Илию, тайно ушёл с учеником Григорием. За шестьдесят вёрст от Вологды, в старинном Авнежском княжестве, преподобный устроил ещё одну Троицкую обитель — Авнежскую пустынь. Первым постриженником там стал местный землевладелец Константин Дмитриевич, в монашестве Кассиан, отдавший обители часть имения.

Слух о новой пустыни дошёл до Москвы, и великий князь Димитрий Донской вызвал Стефана к себе, а монастырю сделал богатый вклад. В столице преподобный встретил юношу-сироту Косму, мечтавшего о монашестве, но не отпускаемого влиятельным родственником. Стефан постриг его в рясофор с именем Кирилл и отвёл в Симонов монастырь — этот юноша стал впоследствии преподобным Кириллом Белоезерским.

В Махрищскую обитель Стефан вернулся по воле князя и святителя Алексия, ввёл там общежительный устав и многие годы управлял братией, время от времени приходя для беседы к преподобному Сергию. В глубокой старости он передал игуменство старцу Илии, принял великую схиму и, причастившись Святых Таин, скончался 14 июля 1406 года.

В 1550 году, при постройке нового каменного Троицкого храма, мощи преподобного были обретены нетленными и оставлены под спудом. Известно и чудо умножения хлеба: в праздник Пятидесятницы в голодный год в обитель пришло до двух тысяч богомольцев, хлеба почти не было, но по молитве к преподобному Стефану накормили всех, и остатков хватило братии ещё на три месяца.