Будущий отшельник родился в новгородской земле, в семье крестьянина. Родители воспитали его в любви к молитве и чтению душеполезных книг, а после их кончины, около 1505 года, он принял постриг в обители преподобного Саввы Крыпецкого под Псковом с именем в честь преподобного Нила Синайского. Десять лет он нёс монастырские послушания, отличаясь смирением и кротостью.

В 1515 году, избегая людской славы, Нил с благословения настоятеля ушёл искать уединения. Он прошёл много необитаемых мест и остановился в лесах у реки Серемхи, где поставил небольшую келью и питался тем, что давал лес. Тринадцать лет прошли в посте и молитве. Молва всё-таки нашла его: к отшельнику потянулись люди за наставлениями, и это его сильно тяготило. В ночных молитвах он просил Пресвятую Богородицу указать ему путь и однажды в тонком сне услышал повеление идти на остров Столобный на озере Селигер.

Он пришёл туда в 1528 году и был поражён красотой места. Первую зиму прожил в пещере, вырытой в горе, потом срубил келью и часовню. На острове он взял на себя подвиг, которым и запомнился: никогда не ложился, а лишь дремал, опираясь на вбитые в стену деревянные крюки. Прожил он здесь двадцать шесть лет, до самой смерти.

Испытаний хватало. Соседи, которым остров прежде был не нужен, решили вырубить на нём лес и распахать землю, а сруб подожгли — но огонь, дойдя до кельи, погас по молитве святого. Приходили и грабители: преподобный сказал им, что сокровище его в углу кельи, где стояла икона Богородицы, и бросившиеся туда ослепли, а после раскаяния прозрели. Ещё Нил безмолвно отказывался принимать приношения от тех, чья совесть была нечиста. За долгую борьбу со страстями он получил от Господа дар духовного рассуждения: по его слову люди исправляли жизнь, а по молитвам утихали селигерские волны и спасались застигнутые бурей рыбаки.

Кончина его была открыта ему заранее — 7 декабря 1554 года. Незадолго до того святого причастил его духовник, игумен Сергий. Преподобный предсказал, что на месте его подвигов встанет обитель, окадил келью и мирно почил, опираясь на крюки. Его погребли в гробу, который он приготовил себе сам. Позже над могилой устроили гробницу, у которой ещё до основания монастыря совершались исцеления, а к концу века на острове возникла Нилова пустынь с общежительным уставом; первым её настоятелем стал иеромонах Герман. В 1598–1600 годах инок Филофей Пирогов составил святому стихиры, канон и житие. Мощи преподобного были обретены нетленными 27 мая 1667 года, во время закладки нового каменного храма, и ныне почивают в Богоявленском соборе обители.

Узнать образ преподобного Нила легче всего по позе: его изображают склонившимся и опирающимся на два крюка, вбитых в стену кельи. Такой извод восходит к иконе, написанной в 1595 году иконописцами Иовом и Нифонтом и положенной на гробницу святого.