Преподобный Исаак родился в восточной Сирии примерно в начале VI века. В молодости он вместе с родным братом поступил в обитель Мар Матфея — огромный монастырь, где в своё время насчитывалось до семи тысяч иноков. Оба выделялись мудростью и постническим усердием. Брат со временем стал настоятелем, а Исаак, освоив общежительные порядки, ушёл в отдельную келью вдали от монастыря и предался безмолвию, никого не принимая. Брат звал его письмами обратно, но он остался твёрд.

Когда слава о подвижнике разошлась, жители Ниневии захотели видеть его своим епископом. После долгих уговоров он, вопреки собственному желанию, принял сан. Служение оказалось недолгим. К нему пришли двое тяжущихся: один требовал вернуть долг немедленно, другой признавал долг, но просил отсрочки, чтобы собрать деньги. Заимодавец пригрозил судом. Епископ напомнил, что Евангелие учит вовсе не требовать взятого назад — значит, тем более можно подождать. В ответ он услышал, что о Евангелии здесь говорить не надо. Тогда Исаак сказал: если Евангелие тут ни при чём, то и делать ему здесь нечего. Кафедру он оставил и тайно ушёл в пустыню, где прожил до смерти. Скончался преподобный в VII веке.

Среди сирийских писателей-аскетов он стоит рядом с преподобным Ефремом Сирином. Его четыре книги об иноческой мудрости переводили и переписывали веками: самый ранний перевод с сирийского на греческий сделали в лавре Саввы Освященного на рубеже VIII–IX веков, и с тех пор его читали не только монахи, но и благочестивые миряне. На славянский творения перевёл преподобный Паисий (Величковский), а в 1854 году в Оптиной пустыни преподобный Макарий Оптинский подготовил русское издание. Письма оптинских старцев показывают, что в духовной жизни они опирались прежде всего на Исаака Сирина и Иоанна Лествичника.

С его именем связана и давняя путаница. Сирийских писателей по имени Исаак было несколько, в том числе несторианских, и их сочинения по сходству имён приписывали епископу Ниневийскому — отсюда и пошло ложное мнение, будто он сам был несторианином. Между тем он жил на век раньше этих авторов. По той же причине так называемый второй том его наследия принадлежит ему не полностью: часть слов вставлена позже и содержит чуждое православию учение.

Преподобных на иконах обычно пишут в монашеском облачении, со свитком в руке — знаком оставленных ими поучений. Для Исаака Сирина это особенно уместно: он остался в памяти Церкви прежде всего как учитель молитвы и внутреннего внимания.