В миру преподобного звали Иваном Железо. Он родился около 1551 года в Галиции, в Покутской области, в благочестивой семье и рано выучился читать. Читал он не детские книги: жития Иоанна Предтечи, творения Иоанна Лествичника, жития Саввы Освященного и Иоанна Дамаскина. Составитель его жития Досифей заметил, что мальчик был мал возрастом, но совершен разумом. В десять лет он ушёл из дому в Угорницкий Спасо-Преображенский монастырь в Карпатах и упросил игумена принять его в братию. Через два года, увидев его кротость и смирение, игумен постриг двенадцатилетнего послушника с именем Иов.

Время для православия на западнорусских землях было тяжелейшее: после Брестской унии храмы отходили униатам, священников лишали приходов. Около 1580 года по просьбе князя Константина Острожского, главного защитника православия в Речи Посполитой, преподобный возглавил Крестовоздвиженский монастырь под Дубно и управлял им больше двадцати лет — как раз тогда, когда давление на веру нарастало.

В начале семнадцатого века он ушёл на Почаевскую гору и поселился в пещере рядом с древней Успенской обителью, где хранилась чудотворная Почаевская икона Божией Матери. Братия полюбила отшельника и избрала его игуменом. Настоятелем он был деятельным и нестрогим к другим: сам много работал, сажал в монастырском саду деревья, укреплял плотины. При нём вырос каменный Троицкий собор и появилась типография — в споре с унией печатное слово было главным оружием, и преподобный сам писал полемические сочинения; сохранилась его «Пчела Почаевская». В 1628 году он участвовал в Киевском Соборе, созванном против унии.

Отдельная и очень долгая часть его жизни — суды. Помещица Анна Гойская завещала обители имения, но её родственник Андрей Фирлей отнял их, разорил монастырь и вывез чудотворную икону. Тяжба тянулась больше двадцати лет и закончилась победой: и земли, и образ вернулись на гору.

При всех этих делах он оставался прежде всего молитвенником. Иисусова молитва была его постоянным деланием; иногда он затворялся в тесной пещере на три дня или на целую неделю. Пещера, где можно только стоять или сидеть, сохранилась в Успенском соборе лавры и до сих пор остаётся местом паломничества. Ученик Досифей записал, что однажды во время молитвы пещеру осиял небесный свет. После 1642 года преподобный принял великую схиму с именем Иоанн.

Он скончался в 1651 году, прожив более ста лет и управляя Почаевской обителью около пятидесяти лет; кончину свою он предсказал заранее. Прославление совершилось 28 августа 1659 года, а 28 августа 1833 года его мощи торжественно открыли для всеобщего поклонения. С 1902 года по определению Святейшего Синода в этот день мощи после литургии обносят вокруг Успенского собора лавры. Преподобных на иконах принято писать в схиме или мантии, со свитком в руке, а основателей обителей — на фоне их монастыря.