Святитель Исаия родился недалеко от Киева, в благочестивой семье. Молодым он оставил мир и пришёл в Киево-Печерский монастырь, где его постриг преподобный Феодосий. Инок жил строго, но без надрыва: был кроток, послушлив, нестяжателен, братолюбив, воздержанием и терпением боролся со страстями.

Слава о нём вышла за стены обители. Когда скончался Варлаам, первый игумен монастыря святого великомученика Димитрия, построенного на княжеском дворе, великий князь Изяслав Ярославич выпросил у преподобного Феодосия себе в настоятели именно Исаию. В 1065 году тот был возведён в игумены и оставался на этом послушании больше десяти лет, не оставляя прежнего смирения и труда. В 1078 году он участвовал в общей молитве печерских старцев о прельщённом бесом подвижнике Никите, будущем епископе Новгородском.

В том же 1078 году, после кончины святителя Леонтия, Исаию поставили на Ростовскую кафедру. Епархия была огромной: в неё входили земли нынешних Ярославской, Владимирской, Нижегородской, Костромской, Вологодской областей и часть Московской, Тверской, Олонецкой. Народ здесь во многом ещё держался язычества — гаданий, чародейства, кровавых обычаев. Его предшественник Леонтий много потрудился для просвещения края, но работы оставалось непочатый край. Древнее житие говорит, что святитель нашёл людей новопросвещённых, ещё не утвердившихся в вере, и усердно напоял их своим учением. Он обходил ростовские и ярославские пределы с проповедью и без страха сжигал языческих кумиров.

Помогал ему в этом великий князь Владимир Мономах: на княжеские средства в Ростове Великом построили собор в честь Успения Пресвятой Богородицы, куда поставили чудотворную икону письма преподобного Алипия Киево-Печерского. К бедным и нуждающимся святитель относился с особой любовью.

С его именем связано и чудесное событие. Когда в Киево-Печерской обители освящали великую соборную церковь, митрополит Иоанн скорбел, что не успел собрать епископов — кафедры были слишком далеко. Исаии же явился светлый Ангел в образе юноши и возвестил о дне освящения. Епископ немедленно собрался и оказался на торжестве 14 августа 1089 года вместе с Лукой Белгородским и Иоанном Черниговским; митрополит был изумлён, потому что никого за ними не посылал.

Немногим больше года после этого святитель пас свою паству. Он скончался 15 мая 1090 года. В 1164 году при закладке нового каменного храма в Ростове его мощи обрели нетленными; с 1474 года, когда их перенесли в самый собор, началось церковное почитание святителя. Иконописный подлинник описывает его так: русый, с бородой пошире, чем у святителя Власия, в архиерейском облачении и белом клобуке, с Евангелием в руках.