Преподобный Исаакий жил в IV веке и происходил, судя по всему, из Сирии. Он подвизался в пустыне, пока не услышал голос с неба, велевший идти в Константинополь. В столице он застал разгар арианской ереси: её держался сам император Валент (364–378), а православные храмы были закрыты.

Когда император собирался на войну с варварами, Исаакий несколько раз выходил к нему навстречу и просил открыть церкви и прекратить гонения. За настойчивость его избили царедворцы, а Валент приказал бросить монаха в топкое болото, откуда живым не выбиралось ничто. По церковному преданию, святого спасли два ангела. Придя к императору в последний раз, он предсказал ему поражение и гибель в огне. Разгневанный Валент велел держать его в темнице до своего возвращения. Возвращения не было: войско разбили варвары в походе против вестготов, а сам император, спасаясь бегством, погиб при пожаре в деревянном амбаре. О встрече монаха с императором и об этом предсказании пишут не только жития, но и церковные историки — блаженный Феодорит Кирский и Созомен.

Новый император Феодосий Великий (379–395), услышав о пророчестве, приказал освободить узника и с почестями принял его во дворце. Исаакий хотел вернуться в пустыню, но знатные горожане Сатурнин и Виктор упросили его не оставлять духовных детей. Каждый выстроил для него келью в своём имении, и святой выбрал ту, что поскромнее, — келью Сатурнина за городскими стенами. К нему шли люди из города, он посещал дома по просьбам хозяев, а нищим отдавал последнее: встретив просящего на дороге, снимал с себя плащ. Со временем вокруг кельи вырос монастырь, позже названный Далматовым, — его считали древнейшим в Константинополе.

Чувствуя приближение смерти, преподобный созвал учеников, наставил их в правой вере и назначил преемником одного из них, по имени Далмат. Похоронили святого торжественно, при участии императора; по просьбе братии его положили в алтаре церкви первомученика Стефана, стоявшей рядом с монастырём.

С годом кончины у исследователей нет единства. Житие указывает 383-й, но другие свидетельства говорят, что преподобный был жив ещё в 406 году, когда навещал преподобного Ипатия Руфинианского. Поэтому сегодня датой смерти считают время после 406 года, а называют и 416-й, и 424–425-й. Частицы мощей преподобных Исаакия и Далмата, по сведениям исследователя О. Мейнардуса, хранятся в афонском скиту Новая Фиваида.

В России почитание святого связано с Петром I: день рождения императора, 30 мая, совпал с днём памяти преподобного, и Пётр считал его своим небесным покровителем. В честь Исаакия Далматского в Петербурге и возведён Исаакиевский собор.