Преподобный Стефан родился во второй половине XV века в Вологодской земле. Отец его служил при княжеском дворе, дал сыну лучшее по тому времени образование и готовил себе преемника, но придворная жизнь юношу не привлекала.

Он ушёл в Глушицкую обитель преподобного Дионисия, где его приняли сперва послушником, а потом постригли с именем Стефан и отдали под начало опытному старцу. Дни там проходили в монастырских трудах, ночи — в молитве. Через несколько лет он с благословения настоятеля отправился странствовать по северным монастырям, чтобы присмотреться к подвигам старцев и научиться духовному деланию. Некоторое время жил в Тихвине, радуясь возможности каждый день молиться у чудотворной иконы, но многолюдство обители его тяготило, и он вернулся в вологодские пределы.

Переходя из леса в лес, преподобный вышел к Комельскому озеру, окружённому мхами и болотами. Место это было безлюдным, и он остался. На восточном берегу, при истоке реки Комелы, Стефан поставил келью и небольшую часовню для двух икон, принесённых из Тихвина, — Божией Матери и Николая Чудотворца. Первые годы дались тяжело: хлеба он принёс с собой немного, и голод был близок. Больше двух лет спустя его случайно нашли два зверолова, поделились дорожным запасом и показали тропу к жилым местам; через них о пустыннике узнали и другие.

Однажды летней ночью, когда преподобный со слезами молился в часовне, ему явились Пресвятая Дева и святитель Николай. Стефан пал на землю и слышал, как святитель просил Матерь Божию благословить это место под иноческую обитель. Богородица повелела построить здесь храм во имя святителя Николая, а самому Стефану быть начальником новой обители.

Через три года к нему пришли жить два брата, затем ещё несколько человек. С одним из них преподобный отправился в Москву за благословением на храм. Митрополит Даниил принял старца с любовью, поселил у себя и представил великому князю Василию Иоанновичу; Стефана рукоположили во священника и поставили игуменом, дали грамоту на устроение обители и церковную утварь, а князь пожаловал земли на содержание братии. В 1534 году церковь во имя святителя Николая была освящена.

После этого преподобный прожил ещё восемь лет, устраивая обитель и во всём подавая пример: кроткий и милостивый к другим, к себе он был строг, изнурял себя трудами, постом и бдением, первым выходил на монастырские работы и старался послужить каждому — так что при своих летах походил в обители скорее на послушника, чем на игумена. Достигнув старости, он за неделю почувствовал приближение конца, сам оделся в заранее приготовленные погребальные ризы, причастился Святых Таин и тихо скончался 12 июня 1542 года.

В тот же год обитель разорили во время набега. Когда на месте сожжённой церкви ставили новую, её сложили уже над могилой преподобного: многие видели над ней свет, будто горели свечи. Тогда же на гробнице написали его изображение. Известно и посмертное чудо: вологодский купец Гавриил, знавший Стефана при жизни, попал на воде в страшную бурю и стал призывать угодников Божиих; в лодке явился ему светлый старец, назвавшийся смиренным строителем обители святителя Николая на Комельском озере, — и буря утихла.