Преподобный Пафнутий родился в 1394 году в селе Кудинове недалеко от Боровска и во крещении был назван Парфением. Дед его, баскак Мартин, — ордынский сборщик дани — принял крещение и остался на Руси; отец преподобного, Иоанн, был его сыном, мать звали Фотинией.

Двадцати лет Парфений ушёл из родительского дома, а в 1414 году настоятель Маркелл постриг его в Покровском монастыре на Высоком с именем Пафнутий. Когда прежний настоятель скончался, братия выбрала Пафнутия игуменом, и около 1426 года святитель Фотий, митрополит Киевский, рукоположил его в священный сан. Тридцать лет провёл преподобный в Покровской обители — и настоятелем, и старцем-духовником.

На пятьдесят первом году жизни он тяжело заболел, оставил игуменство и принял великую схиму. Выздоровев, 23 апреля 1444 года, в день памяти великомученика Георгия Победоносца, Пафнутий ушёл из монастыря и поселился с одним иноком на левом берегу Протвы, там, где в неё впадает река Истерьма. Скоро к нему стали собираться иноки, число их быстро росло, и вместо прежнего деревянного храма поднялся новый каменный — в честь Рождества Пресвятой Богородицы. Расписывал его лучший иконописец того времени Дионисий со своими помощниками.

Устав в новой обители преподобный держал строгий, но требовал прежде всего с себя. Келья у него была беднее всех, из пищи он брал худшее, по понедельникам и пятницам не ел вовсе, а по средам держался сухоядения. Из общих работ выбирал самые тяжёлые: рубил и носил дрова, копал и поливал огород — и при этом первым приходил на церковную службу. Его глубоко любили и почитали не только в собственном монастыре, но и в других обителях.

Однажды к нему пришёл двадцатилетний юноша Иоанн Санин. Испытав его, преподобный совершил постриг с именем Иосиф — так у Пафнутия появился ученик, будущий преподобный Иосиф Волоцкий, твёрдый хранитель чистоты православной веры, которого учитель сам благословил на его дальнейший подвиг.

Свою кончину преподобный предсказал за неделю. Он исполнил последнюю молитву, благословил братию и отошёл ко Господу 1 мая 1477 года. Церковное предание называет его последователем преподобного Сергия Радонежского.

Преподобных на иконах пишут в монашеской мантии и куколе, с развёрнутым свитком в руке; основателей монастырей нередко изображают с моделью построенной ими обители. Память преподобного Пафнутия Боровского совершается 14 мая.