Преподобный Исаак жил в середине VI века. В италийский город Сполето он пришёл из Сирии. Придя, попросил у пономарей разрешения остаться в храме — и молился в нём двое с половиной суток подряд. Один из пономарей стал укорять пришельца в лицемерии и ударил его по щеке. Наказание последовало тут же: злой дух поверг обидчика к ногам святого с криком, что Исаак его изгонит; стоило преподобному склониться над лежащим, как дух отступил.

Весть об этом быстро разнеслась по городу, и к преподобному потянулись люди, предлагая средства и помощь на устройство монастыря. Он отказался от всего, вышел за город и поселился в уединённом месте, построив себе маленькую келью. Вокруг него собрались ученики — так возник монастырь. На вопросы братии, почему он не принимает приношений, старец отвечал коротко: «Монах, приобретающий имения, уже не монах».

Преподобный обладал даром прозорливости, и святитель Григорий Двоеслов записал о нём несколько случаев в своей книге о жизни и чудесах италийских отцов.

Однажды Исаак велел инокам оставить на ночь в огороде все заступы, а наутро просил приготовить еду для работников. Оказалось, что воров, собравшихся ограбить монастырь, было ровно столько, сколько оставленных заступов, и сила Божия переменила их намерение: они взяли лопаты и трудились так усердно, что к приходу иноков вся земля была вскопана. Преподобный поприветствовал их, пригласил подкрепиться, посоветовал оставить воровство и разрешил впредь открыто приходить и пользоваться плодами монастырского огорода.

В другой раз к нему пришли странники в рубищах и просили одежды. Он велел им подождать, а сам послал инока в лес — туда, где в дупле дерева они спрятали свои хорошие одежды, желая обмануть игумена. Инок принёс их, и преподобный отдал спрятанное самим просителям; обман открылся, и вымогатели ушли в великом стыде.

Ещё случай: некий человек послал преподобному слугу с двумя корзинами еды, а слуга одну по дороге припрятал. Приняв принесённое, старец тихо сказал, чтобы тот не прикасался к спрятанной корзине: в неё вползла змея, и протянутая рука будет ужалена. Так мудро и незлобиво он обличал чужие грехи, желая всем спасения.

Скончался преподобный Исаак в 550 году. Важно не путать его с другим святым того же имени — преподобным Исааком Сириным, епископом Ниневийским, знаменитым писателем-аскетом, который жил в VII веке и память которого совершается 28 января.

Преподобных принято писать в монашеском облачении, со свитком в руке; на образе Исаака Сполетского обычно ставят полное надписание с уточнением, чтобы отличить его от тёзки.