Тимофей был родом из ликаонского города Листры в Малой Азии. Ко Христу он обратился в 52 году, и обратил его апостол Павел. Случилось это так: Павел и Варнава впервые пришли в ликаонские города, и в Листре Павел исцелил человека, хромого от рождения. Многие тогда уверовали, среди них юноша Тимофей, его мать Евника и бабка Лоида.

Семена этой проповеди дали обильный плод. Тимофей стал ревностным учеником, а потом и неотлучным спутником Павла, его помощником в благовестии. Апостол любил его и в посланиях называл своим возлюбленным сыном, с благодарностью вспоминая его верность; он писал, что Тимофей последовал ему и в учении, и в житии, и в вере, и в терпении, и в гонениях.

В 65 году апостол Павел рукоположил его во епископа Ефесской Церкви — ею святой Тимофей управлял пятнадцать лет. А когда Павел сидел в римской темнице и знал, что впереди у него мученическая смерть, он вызвал верного ученика к себе на последнее свидание.

Погиб Тимофей в Ефесе. Язычники справляли праздник в честь идолов: носили их по городу, распевая и совершая свои обряды. Епископ пытался остановить и вразумить людей, проповедуя им веру во Христа. Толпа в озлоблении набросилась на него, его били, волочили по земле и наконец побили камнями. Это было в 80-м году. В IV веке мощи апостола перенесли в Царьград и положили в храме Святых Апостолов. Церковь чтит святого Тимофея в числе семидесяти апостолов.